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干细胞发育与分化分子机制

        干细胞生物学是近年来生命科学领域研究的热点。重点实验室多个课题组使用不同的模式系统在多层水平研究干细胞生物学的重要科学问题,如:胚胎干细胞的多能性维持和分化网络、重要多能性转录因子的调控、生殖干细胞发育与信号转导调控、以及成体干细胞分化以及异常分化与疾病的关系等。近年来,重点实验室在干细胞发育研究方向取得了一系列原创性成果,以通讯作者在Development、Genome Research、Stem Cells 等主流期刊发表论文多篇。

        生命的延续需要在维持干细胞自我更新同时又限制其过度增殖。果蝇生殖干细胞是研究干细胞发育最成熟、最优异的系统之一。在果蝇卵巢的前端有一个被称为干细胞微环境的结构,稳定地维持2-3个生殖干细胞的存在。这个干细胞微环境由terminal filament、cap cell 和escort cell等体细胞组成。Bam基因是生殖干细胞分化的关键性因子,而它的表达被BMP信号通路直接抑制。BMP信号因子在其它组织中具有长距离效应,而在果蝇卵巢干细胞微环境中,BMP信号通路所影响的范围只有一个细胞的范围,只有紧靠cap cell的生殖细胞成为干细胞。对生殖细胞而言,为什么BMP信号能如此精确地局限于一个细胞直径范围内呢?

        研究发现蛋白糖Dally对于维持生殖干细胞是必需的。Dally集中表达在cap cell中。细胞特异的Dally RNAi实验、突变体的克隆分析、和细胞特异表达Dally拯救干细胞丢失表型的实验,为Dally在cap cell中作用维持干细胞功能提供了充分的实验证据。此外,通过检测生殖干细胞内BMP信号通路的3个成员,证实了Dally通过 BMP信号通路促进生殖干细胞更新。Dally影响生殖干细胞的重要作用还表现在:当在干细胞微环境之外过表达Dally,生殖干细胞的数目明显增多,Dally的表达范围似乎可以决定促进干细胞命运的微环境。当没有Dally的时候,生殖细胞对BMP信号的敏感度极低,而体细胞则不依赖Dally。综上所述,糖蛋白Dally通过BMP信号通路将卵巢生殖干细胞微环境精确地控制在1个细胞范围内。该研究论文发表在Development(2009,136: 3627-35)。

    胚胎干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞。其中Oct4和Nanog是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持其全能性的关键的两个转录因子。在对Oct4蛋白的研究中发现Oct4基因可以形成不同的蛋白异构体,其不同异构体的翻译机制、亚细胞定位以及功能等都存在一定的差异,提示Oct4在干细胞的增殖、分化、应激反应、凋亡过程等多个生物学过程中发挥着重要的作用。在对Nanog表达调控的研究中发现,Nogo-66可以活化NgR通过Stat3信号途径促进 Nanog 的表达,提示Nogo-66/NgR信号途径参与Nanog 的表达调控。相关结果已发表在Stem Cells(2009, 2010)等杂志,这些工作丰富了干细胞自我更新调控的分子网络,为进一步了解干细胞自我更新和定向分化的调控机制奠定了基础。
 
        BMP作为胚胎发育早期的形态发生素,决定胚层的形态并调控多细胞分化程序。 BMP也是胚胎干细胞生长重要的调控因子之一。然而BMP直接靶基因以及BMP信号在哺乳动物发育过程中的作用还知之甚少。采用染色体免疫共沉淀技术(ChIP)结合DNA启动子序列芯片(ChIP-chip)以及Solexa深度测序(ChIP-seq),绘制了Smad1/5和Smad4在鼠ES细胞全基因组范围内注释基因启动子区域的DNA结合图谱。研究发现了Smad1/5和Smad4的结合蛋白中富集了发育调控因子及被H3K27三甲基化和H3K4三甲基化共价修饰的基因,这些基因在ES细胞自我更新状态下受到抑制,而一旦受到分化信号的诱导就会被激活。 Smad 敲降实验结果进一步说明Smad介导的BMP信号通路对分化相关过程至关重要,而不直接影响细胞的自我更新。在Smad相关基因中有两个在BMP介导的早期神经分化过程中的调节基因——Dpysl2和H3K27去甲基酶Kdm6b。实验结果结合计算分析显示,Smad介导的BMP信号通过调控一系列发育调控蛋白调节了自我更新与分化之间的平衡。BMP信号对于胚胎干细胞自我更新能力的维持是非必需的,但是对于正确的细胞谱系的决定是必要的。该研究成果发表在Genome Research(2009, 20: 36-44)。
 
       血液干细胞分化异常或者血液前体细胞生长稳态失衡是血液肿瘤发生的主要原因,血液干细胞的研究一直是成体干细胞研究的重点之一。其中血液干细胞与儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)有着密切的关系。依据不同的细胞起源、不同的分化程度,又可将这种白血病分为不同的亚型。不同的亚型对药物的耐受性有较大差异,因此有效治疗儿童急性淋巴细胞白血病需要在明确分型的基础上进行,目前临床上主要采取免疫学、细胞形态学、细胞遗传学等方法等几种分类方法,但成本较高。在本研究中我们首次开发了可用于单个样本表达谱分类并具有高度独立样本中验证准确率的儿童白血病分类器。

       本研究共收集了三套国外已发表的急性淋巴白血病 (ALL) 的全基因组Affymetrix芯片数据,共535例样本。研究基于递归支持向量机的递归特征筛选法 (SVM-RFE) 对这535例样本进行临床亚型分析,筛选出62个与临床亚型密切相关的特征基因。并在此基础上构建了用于ALL分类的数学模型。用重新构建的分类模型对535例国外ALL样本进行10-fold交叉验证,分类结果与国外实验室基于实验的分类结果符合率达97.6%(图16)。然后又用北京儿童医院的100例已通过临床分型的ALL样本对上述分类模型进行了验证,亚型分类准确率达97%。

       该分类模型与之前其他实验是构建的ALL分类模型相比有以下三点独特的优势:首先我们仅用很少的特征基因(62个)就达到了很高的分型准确率(97%),少于国外类似模型中的80~300个特征基因,这个分类模型对临床应用有很大意义。其次,研究使用了大量的数据(三套数据,共535例样本)用来构建分类模型和进行交叉验证,确保了构建的分类模型的稳定性。第三,分类模型可以不加任何修正地对一个完全独立的新样本进行分类,并且能达到与训练数据相似的高准确率。
基于535例ALL的芯片数据,还研究了进行了ALL各个亚型中基因调控网络。首先将每一个ALL亚型与其他ALL样本比较,挑出该亚型中最特异的50个高表达基因和50个低表达基因;其次在这些差异表达基因转录起始位点的上游1000个碱基的序列中查找可能结合转录调控因子 (TF) 的位点,并预测调控关系;然后用从芯片数据算出来的皮尔森相关系数 (PCC) 对预测出的调控关系进行过滤,只留下相关系数绝对值较高的那些调控关系;最后构建出每一个ALL亚型的调控网络。该论文发表在Blood(2009, 114: 4486-4493)。

 

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